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2020-10
新冠病毒的解碼者，宏基因組學(xué)焦點(diǎn)中的NO.1——mNGS
2003年SARS的發(fā)現(xiàn)耗時5個多月，
2013年H7N9的發(fā)現(xiàn)用了1個多月，
2019年新冠病毒的全基因組測序僅5天，
得益于高通量測序技術(shù)（NGS）的快速發(fā)展。
那么，mNGS在臨床中的實(shí)際應(yīng)用如何呢？
一篇頂刊綜述為您揭曉：
摘要：臨床宏基因組學(xué)（mNGS）是對患者樣本中微生物和宿主遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）進(jìn)行綜合分析的一種新興的診斷技術(shù)，這種新興的方法正在改變醫(yī)生診斷和治療疾病的方式，其應(yīng)用范圍廣泛，其應(yīng)用范圍包括抗菌素耐藥性研究、微生物組學(xué)、人類宿主基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）和腫瘤學(xué)。
原名：Clinical metagenomics
譯名：臨床宏基因組學(xué)
期刊：Nature Reviews Genetics
IF：33.133
發(fā)表時間：2019年3月27日
通信作者單位：美國加州大學(xué)舊金山分校實(shí)驗醫(yī)學(xué)系
綜述框架
綜述回顧了mNGS在臨床和公共衛(wèi)生環(huán)境中的各種應(yīng)用， 討論了在臨床實(shí)驗室中采用mNGS所面臨的挑戰(zhàn)，并提出了克服這些挑戰(zhàn)的步驟。同時展望了mNGS在臨床領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。
臨床微生物學(xué)領(lǐng)域包括診斷微生物學(xué)、從臨床樣本中識別病原體以指導(dǎo)感染患者的管理和治療策略、公共衛(wèi)生微生物學(xué)以及社區(qū)監(jiān)測和監(jiān)測傳染病暴發(fā)等。
微生物的傳統(tǒng)診斷技術(shù)包括：培養(yǎng)物中微生物的生長和分離，病原體特異性抗體（血清學(xué)）或抗原的檢測以及微生物核酸（DNA或RNA）的分子鑒定，通常是通過PCR進(jìn)行的。
盡管大多數(shù)分子分析使用特定的引物或探針僅靶向有限的病原體，但宏基因組學(xué)方法可表征樣品中存在的所有DNA或RNA，從而能夠分析患者樣品中的整個微生物組以及人類宿主基因組或轉(zhuǎn)錄組。宏基因組學(xué)方法已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年，以表征各種生態(tài)位，從海洋環(huán)境到有毒土壤到節(jié)肢動物疾病載體再到人類微生物組。
mNGS是對患者樣品中微生物和宿主遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）的全面分析，正在迅速地從研究轉(zhuǎn)移到臨床實(shí)驗室。mNGS正在改變醫(yī)生診斷和治療傳染病的方式，其應(yīng)用范圍廣泛，包括抗菌素耐藥性，微生物組，人類宿主基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）和腫瘤學(xué)。mNGS已成為精確診斷傳染病的關(guān)鍵驅(qū)動力，推動了精確醫(yī)學(xué)工作在該領(lǐng)域的個性化患者護(hù)理。
到目前為止，mNGS的臨床應(yīng)用已經(jīng)包括對各種綜合征和樣本類型的傳染病診斷，疾病和健康狀態(tài)下的微生物組分析，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定人類宿主對感染的反應(yīng)以及腫瘤相關(guān)病毒及其基因組整合位點(diǎn)的鑒定等。
一、傳染病診斷：
傳統(tǒng)的診斷病人感染性疾病的臨床模式是由醫(yī)生制定鑒別診斷，然后進(jìn)行一系列測試，試圖找出病因。臨床樣品中病原體常規(guī)檢測的范圍包括鑒定培養(yǎng)中生長的微生物（例如，通過生化表型檢測或基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）飛行時間質(zhì)譜法），檢測生物體特異性生物標(biāo)記物（例如抗原用乳膠凝集試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）抗體試驗或用PCR對單個試劑進(jìn)行核酸試驗。這些通常包括與確定的臨床綜合征有關(guān)的最常見病原體，如腦膜炎和腦炎、急性呼吸道感染、敗血癥或腹瀉病。
分子診斷分析為診斷最常見的感染提供了一種相當(dāng)經(jīng)濟(jì)有效和快速的方法（通常< 2 h的周轉(zhuǎn)時間）。然而，目前使用的幾乎所有常規(guī)微生物試驗一次只能檢測一種或有限的病原體，或者要求從臨床樣本中成功培養(yǎng)微生物。
相比之下，雖然目前使用的NGS分析方法在速度上無法與傳統(tǒng)的檢測方法相比——在Illumina儀器上單獨(dú)進(jìn)行的測序需要超過18小時，但mNGS可以使多種病原體——病毒、細(xì)菌，真菌和/或寄生蟲——根據(jù)唯一可識別的DNA和/或RNA序列從培養(yǎng)物或直接從臨床樣本中識別。原則上，幾乎所有的病原體，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲，都可以在一次檢測中鑒定出來。NGS方法的另一個關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是，測序數(shù)據(jù)可能被用于除了鑒定致病病原體之外的其他分析，例如通過RNA測序（RNA-seq）對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，從而確定微生物組特征和人類宿主反應(yīng)的平行分析。
因此，mNGS在診斷中的臨床應(yīng)用可能是在最難診斷的病例中，或者對于潛在病原體譜更廣的免疫功能低下的病人。臨床樣本的非靶向mNGS可能是最有前途的感染綜合診斷方法。
二、臨床微生物組分析：
許多研究人員現(xiàn)在用mNGS代替16SrRNA基因的靶向測序來深入鑒定微生物組。公眾越來越認(rèn)識到微生物組可能參與急性和慢性疾病的狀態(tài)。然而，目前還沒有一種基于微生物組學(xué)的檢測方法被臨床用于疾病的診斷或治療，部分原因是人們對微生物組學(xué)的復(fù)雜性及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用認(rèn)識不足。
微生物組學(xué)分析在Clostridiumdifficile相關(guān)疾病的治療和治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。C. difficile能感染腸道，產(chǎn)生毒素，可導(dǎo)致腹瀉、脫水、敗血癥和死亡。C. difficile難治性感染只發(fā)生在微生物群的環(huán)境中，而微生物群的環(huán)境會因暴露于廣譜抗生素或最近的胃腸道手術(shù)等因素而改變。糞便移植治療和潛在治療C. difficile感染的有效率為80%-90%，這突出了微生物群在艱難梭菌感染中的重要性。在多個研究中使用mNGS來表征微生物組分有助于細(xì)菌-益生菌混合物的開發(fā)，這種混合物可以作為預(yù)防或治療艱難梭菌相關(guān)疾病的藥丸使用。
微生物組的另一個潛在應(yīng)用是分析細(xì)菌多樣性，這可以提供病人的疾病是傳染性的還是非傳染性的線索。例如，一項用于鑒別肺炎患者呼吸道病原體的mNGS研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)感染的個體其呼吸道微生物組的多樣性顯著降低。這種被稱為失調(diào)的微生物群的改變也被證明與對于肥胖、糖尿病和炎癥性腸病，微生物群的操作可能是治療這些病理狀況的一個途徑。
三、人類宿主感染反應(yīng)分析：
mNGS側(cè)重于微生物的reads數(shù)，然而，在研究人類宿主對感染的反應(yīng)時，基因表達(dá)分析有一個補(bǔ)充作用。盡管RNAseq分析通常是在全血或外周血單個核細(xì)胞（PBMC）樣本上進(jìn)行的，但任何體液或組織類型都可能適用于這些分析。利用RNA-seq表達(dá)譜對基因進(jìn)行分類已被用于描述幾種感染，包括葡萄球菌菌血癥、萊姆病、念珠菌病、結(jié)核病（區(qū)分潛在和活動疾病風(fēng)險）和流感。基于機(jī)器學(xué)習(xí)的RNA-seq數(shù)據(jù)分析已被用于癌癥分類，而這些方法的使用可能對傳染性疾病很有希望。
人類宿主的RNA-seq分析可用于直接從臨床樣本中識別新的或未被充分認(rèn)識的宿主-微生物相互作用，如之前對萊姆病、登革熱或瘧疾患者所示。RNA-seq在病原菌僅短暫存在的臨床病例中可能特別有用（例如早期萊姆病或蟲媒病毒感染，包括西尼羅河病毒）；類似于血清學(xué)檢測，根據(jù)病原體特異性人類宿主反應(yīng)，間接診斷感染是可能的。對病原體特異性宿主反應(yīng)的分析也可能有助于在復(fù)雜的臨床亞基因組樣本（如多微生物膿腫或呼吸道流感）中鑒別真正的病原體。
RNA-seq的另一個有前途的應(yīng)用是在區(qū)分急性疾病的傳染性和非傳染性病因。例如，如果根據(jù)宿主反應(yīng)判斷一種疾病更可能是非傳染性的（例如，自身免疫性疾?。?，臨床醫(yī)生可能更愿意停止使用抗生素，并用類固醇和其他免疫抑制藥物積極治療患者。
四、腫瘤學(xué)應(yīng)用：
在腫瘤學(xué)中，識別突變基因的全基因組或定向NGS方法可用于同時發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)的病毒（即皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒和多瘤病毒）和/或收集病毒與宿主相互作用的數(shù)據(jù)。
例如，mNGS對發(fā)現(xiàn)Merkel細(xì)胞多瘤病毒（圖1D）至關(guān)重要，目前認(rèn)為Merkel細(xì)胞癌是一種罕見的皮膚癌，最常見于老年患者。迄今為止，美國食品和藥物管理局（FDA）已批準(zhǔn)臨床使用兩個NGS小組測試腫瘤樣本中可操作的基因組畸變。在這些樣本中檢測與整合病毒和外源病毒相對應(yīng)的讀碼，可以在面板上添加特定的病毒探針，也可以在對整個腫瘤基因組或菲氏體進(jìn)行測序時偶然完成。
對癌癥中的綜合性或活動性病毒感染及其參與信號傳導(dǎo)途徑的額外了解，可為靶向抗病毒和/或化療藥物的預(yù)防和治療干預(yù)提供信息，這一點(diǎn)可通過治療后丙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的風(fēng)險降低來證明直接作用的抗病毒藥物。在未來，液體活檢標(biāo)本（如血漿）中無細(xì)胞DNA的mNGS可用于免疫功能低下患者早期癌癥的同時鑒別和感染的診斷。
總結(jié)與展望
作為一種綜合性的直接檢測方法，mNGS可能最終取代臨床微生物學(xué)中的培養(yǎng)、抗原檢測和PCR方法，改變醫(yī)生診斷和治療傳染病的方式。
研究團(tuán)隊預(yù)測在未來5年內(nèi)，評估m(xù)NGS臨床效用和成本效益的前瞻性臨床試驗數(shù)據(jù)將可用；mNGS的總體成本和周轉(zhuǎn)時間將繼續(xù)下降；mNGS的其他方面（如納入人類宿主反應(yīng)和微生物組學(xué)數(shù)據(jù)）將證明臨床上有用；自動化樣本處理和微流控設(shè)備將被開發(fā)用于按鈕操作；計算分析平臺將更廣泛地用于本地和云端，從而消除對專門的生物信息學(xué)專業(yè)知識的需求。
我們將見證mNGS的廣泛民主化，因為基因組分析不僅對醫(yī)生和研究人員開放，而且還通過眾包計劃廣泛地向患者和公眾開放。此外，在一個病原體不斷出現(xiàn)的世界里，我們設(shè)想基于mNGS的檢測將在監(jiān)測和跟蹤新的疾病爆發(fā)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)和測序等快速診斷平臺在全球的部署，將有可能在更早的階段發(fā)現(xiàn)并控制傳染病爆發(fā)，從而拯救生命和降低成本。在不久的將來，隨著我們與傳染病的長期斗爭，mNGS將不再是一種奢侈品，而是臨床醫(yī)生醫(yī)療設(shè)備中的必需品。
參考文獻(xiàn)
Chiu,C.Y.,Miller,S.A.Clinical metagenomics.Nat Rev Genet 20, 341–355 (2019). https://doi.org/10.1038/s41576-019-0113-7
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