04
2022-08
Citation 導言 結直腸癌(CRC)是第三大常見癌癥，占全球所有新癌癥病例的10%，是全球癌癥相關死亡的第二大原因，導致2020年近100萬人死亡，且年輕者發(fā)病率不斷上升[1,2]。在中國，結直腸癌的新發(fā)病人數(shù)僅次于肺癌，成為第二大癌癥，據(jù)最新數(shù)據(jù)，我國83%的結直腸癌患者在首次確診時處于中晚期，其中44%的患者已經(jīng)出現(xiàn)了肝、肺等部位的轉移。盡管當前結直腸癌的治療策略有了進步，但結直腸癌患者的預后僅略有改善，而開發(fā)新治療方法PI3K/mTOR抑制劑對攜帶RNF43 p.G659fs突變的結直腸癌患者是否具有治療應用價值亟待對疾病機制的了進一步了解，確定關鍵基因變異的特定功能對于促進新的靶向治療方法至關重要，并最終改善患者的預后。
研究背景
RNF43基因（Ring Finger Protein 43）編碼一種環(huán)型E3泛素連接酶，它作為Wnt信號通路的負調(diào)節(jié)因子主要是通過降解Wnt受體Frizzled來實現(xiàn)。因此，RNF43功能的喪失將導致腫瘤細胞依賴分泌的Wnt配體來存活[3-5]。 RNF43是CRC和其他惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生突變的基因，且RNF43 p.G659fs突變在約8%的CRC患者中出現(xiàn)，尤其是在DNA錯配修復缺陷(dMMR)/高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H)的患者中更常見[6]，但其作為熱點突變的功能影響還有待進一步研究，且也沒有針對的特定療法，探索其中機制對新療法開發(fā)至關重要。 本文小編將帶大家一起看看這篇刊登于Nature Communications的文章：RNF43 G659fs is an oncogenic colorectal cancer mutation and sensitizes tumor cells to PI3K/mTOR inhibition（譯名：結直腸癌致突變RNF43 G659fs可使腫瘤細胞對PI3K/mTOR抑制劑敏感），從機制上探索PI3K/mTOR抑制劑對攜帶RNF43 p.G659fs突變的結直腸癌患者是否具有治療應用價值。
研究背景
RNF43659mut具有不依賴Wnt的致癌作用 為研究RNF43上兩個熱點移碼突變（p.R117fs和 p.G659fs）的功能。經(jīng)過CRISPR-Cas9編輯構建的RNF43117mut和RNF43659mut等基因細胞系。在培養(yǎng)之初加入Wnt-3a，結果顯示，與對照組相比，RNF43117mut組在加入Wnt-3a后生長顯著加速。而RNF43659mut組沒有明顯差別（圖1）。且RNF43659mut組增加了三個株系聚落形成（圖1），而這些聚落的形成與Wnt-3a和APC無關。表明了RNF43117mut的功能是Wnt依賴性的，而RNF43659mut不是。為了進一步驗證結果，使用TOP/FOP熒光素酶報告分析測量Wnt信號活性。發(fā)現(xiàn)補充Wnt-3a的RNF43117mut組顯著增加Wnt信號。與對照組相比，RNF43659mut組Wnt信號未顯著增加（圖2） 圖1 圖2 （注：熒光素酶報告物測定所示CRISPR編輯細胞中的Wnt信號活性） RNF43659mut激活PI3K/AKT信號通路，易受PI3K/mTOR抑制劑的影響 為了發(fā)現(xiàn)RNF43659mut CRC細胞潛在的治療藥物，對RNF43659mutCRC細胞進行了全面的藥篩。在5363種處于臨床前和臨床開發(fā)不同階段的化合物列表中，分別篩選出了30種和22種PI3K/mTOR途徑的藥物。與二甲基亞砜處理和等基因對照相比，該途徑在選擇性靶向RNF43659mut的重組文庫化合物中顯著富集（圖3）。發(fā)現(xiàn)五種化合物alpelisib，PF-04691502，PKI-179，Torin-1和Torin-2，在RNF43659mut等基因細胞系中表現(xiàn)出顯著的選擇性殺傷效果（圖4，6）。此外，對RNF43 p.G659fs 過表達細胞中使用五種化合物的劑量-反應曲線中，五種化合物對RNF43659mut細胞和過表達RNF43659mut細胞顯示出有效和選擇性毒性，但對sgRNA對照細胞或野生型過表達細胞沒有毒性（圖5）。這些結果共同證明了RNF43659mut激活PI3K/AKT信號，PI3K/mTOR抑制劑可以靶向殺傷RNF43659mut突變的腫瘤。 圖3 圖4 圖5 Venn圖顯示HT29、LS513 RNF43659mut編輯細胞和HCT116 RNF43659mut過度表達細胞中PI3K/mTOR顯著候選化合物重疊（紅色），其中n為在每個細胞系的二次篩選中驗證的主篩選中的化合物數(shù)量 圖6 CRC RNF43 G659fs臨床前模型中PI3K/mTOR復合效率的評估 RNF43659mut通過RNF43659mut-p85相互作用激活PI3K/AKT信號 研究發(fā)現(xiàn)RNF43 p.G659fs突變在體外和體內(nèi)激活PI3K，并表明這種激活是通過降解PI3K調(diào)節(jié)亞基p85發(fā)生的。在突變體中，RNF43 p.G659fs通過結合降解p85來消除p85對PI3K/AKT信號的抑制，從而激活PI3K/AKT信號，加快癌細胞的生長，并且RNF43 p.G659fs誘導的PI3K/AKT信號激活可以被PI3K/mTOR抑制劑逆轉。這也進一步證明PI3K/mTOR抑制劑能通過直接抑制PI3K/AKT信號，從而抑制攜帶RNF43 p.G659fs突變腫瘤細胞的生長。 圖7 泛素免疫沉淀分析評估觀察到RNF43659mut增加了P85的泛素化 RNF43659mut調(diào)節(jié)干擾素基因表達 研究對RNF43659mut等基因細胞系的RNA測序揭示了降低干擾素-α和-γ反應的基因表達，這些基因集分別有助于炎癥反應和先天性免疫反應，且這種降低的活性可以被PI3K/mTOR抑制劑恢復，這說明RNF43659mut可能改變腫瘤免疫環(huán)境。
研究結論
本研究證明了RNF43 p.G659fs突變具有不依賴Wnt的致癌作用，RNF43 p.G659fs與p85亞基結合降解，消除p85對PI3K/AKT信號通路的抑制作用，可導致PI3K信號增強，因而PI3K/mTOR抑制劑可以逆轉p.G659fs誘導的PI3K/AKT信號通路的激活，它可對攜帶該突變的結直腸腫瘤選擇性殺傷。驗證了PI3K/mTOR抑制劑在治療RNF43 p.G659fs突變型癌癥中具有應用價值，另外基于RNF43659mut調(diào)節(jié)干擾素基因表達，也提出了將免疫治療和PI3K/mTOR抑制劑結合進行治療的可能性，尤其是治療失敗的DNA錯配修復缺陷(dMMR)/高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H)結直腸癌患者。因此對RNF43 p.G659fs突變型結直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)為未來治療新方法的開發(fā)拓展了新視野。
研究啟示
文中建立了CRC患者來源的類器官，腫瘤組織取自患者來源的RNF43_G659fs異種移植模型。同時也建立正常的患者來源的結腸類器官。應用類器官進行藥物處理，驗證了PI3K/mTOR抑制劑在RNF43659mut等基因細胞系和異種移植模型(PDX)，以及在患者來源的含有RNF43 p G659fs突變的類器官中都產(chǎn)生了良好的抗腫瘤活性。 作者之所以如此選擇，因為不同的模型都有其自身的局限性，細胞系包含的細胞類型過于單一，喪失了腫瘤的異質性。而人源腫瘤異種移植模型，不僅存在人鼠之間物種的差異，而且成本高昂、建模周期長和建模成功率低，也無法高通量使用等問題。相比來說，類器官具有擬合度高、培養(yǎng)周期短、傳代穩(wěn)定、易自動化等優(yōu)勢，具備了高通量使用的條件。 類器官技術是科技部發(fā)布了“十四五”國家重點研發(fā)計劃的6個重點專項之一，由于類器官技術本身具有極高的創(chuàng)新性，類器官已成為疾病研究、新藥開發(fā)領域最受矚目的模型，深受基金項目申請和高分雜志的青睞，使用類器官發(fā)表文章及申請國自然都是很有優(yōu)勢的。 廣州精科醫(yī)學檢驗所有限公司 廣州精科醫(yī)學檢驗所有限公司是精科生物集團旗下的全資子公司，是一家以類器官技術+基因組學技術為雙驅核心的第三方醫(yī)學檢驗所。公司在類器官方向致力于推動類器官技術的轉化與應用，在科研上打造全面的類器官技術服務體系，而在臨床上提供高效的類器官+NGS的綜合檢測服務。 ★ PIC.08 精科腸癌類器官 HE圖片 參考文獻 [1]Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J. Clin. 70, 7–30 (2020). [2]Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, 330–337 (2013). [3]Wong, C. C. et al. SLC25A22 promotes proliferation and survival of colorectal cancer cells with KRAS mutations and xenograft tumor progression in mice via intracellular synthesis of aspartate. Gastroenterology 151, 945–960 (2016). [4]Liu, X. et al. Inhibition of PCSK9 potentiates immune checkpoint therapy for cancer. Nature 588, 693–698 (2020). [5]Roig, A. I. et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology 138, 1012–1021 (2010). [6]Zhang, L. et al. Selective targeting of mutant adenomatous polyposis coli (APC) in colorectal cancer. Sci. Transl. Med. 8, 361ra140 (2016).
精科gene蜜網(wǎng)絡商城
精科醫(yī)學微信公眾號
